Kolonie-Polymerasekettenreaktion
Die Kolonie-Polymerasekettenreaktion (englisch colony PCR, umgangssprachlich ‚Kolonie-PCR‘) ist eine molekularbiologische und biochemische Methode zum Nachweis von bestimmten DNA-Sequenzen in Kolonien von Bakterien oder Pilzen durch eine Variante einer Polymerasekettenreaktion.[1][2][3][4]
Prinzip
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]Die Kolonie-Polymerasekettenreaktion verwendet als DNA-Vorlage keine gereinigte Plasmid-DNA oder chromosomale DNA, sondern aus dem Kulturmedium entnommene Bakterienkolonien. Bei Plasmiden mit hoher Kopieanzahl reichen bereits wenige Zellen aus, sie müssen jedoch im PCR-Ansatz in Suspension gebracht werden. Aufgrund der Bindung von Magnesiumionen aus dem PCR-Puffer durch die Bakterien und aufgrund der Erhöhung der Syntheserate der thermostabilen DNA-Polymerase (siehe PCR-Optimierung) wird die Magnesiumkonzentration im Vergleich zur PCR auf 5 millimolar erhöht und gelegentlich das Chaotrop Dimethylsulfoxid hinzugegeben. Die Lyse der Zellen und die Freisetzung der DNA aus dem Cytoplasma erfolgt entweder durch eine vorhergehende Lyse durch kurzes Erhitzen auf 95 °C und eine Reinigung oder durch Zusätze im Puffer, wie beispielsweise EDTA oder SDS in Verbindung mit dem Erhitzungsschritt zu Beginn der PCR oder ohne Vorbehandlung mit einer Lyse im ersten Denaturierungsschritt der PCR.[5][4] Bei Hefen wurde eine Kolonie-Polymerasekettenreaktion mit einem Lyse-PCR-Puffer mit Lytikase, Octoxinolen, Polysorbaten und Gelatine beschrieben.[6] Eine Variante der Kolonie-Polymerasekettenreaktion mit einer reversen Transkription wird zur Einzelzellanalyse von Säugerzellen verwendet.[7] Nach der PCR erfolgt meistens eine Analyse der vervielfältigten DNA per Agarose-Gelelektrophorese, gelegentlich auch eine DNA-Sequenzierung.[5]
Da Bestandteile des Kulturmediums (sowohl Flüssig- als auch Festmedien) die Reaktion hemmen können, wird deren Menge so gering wie möglich gehalten.[5] Bei der Kolonie-Polymerasekettenreaktion wird meistens parallel eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle verwendet. Die Positivkontrolle enthält die gleiche DNA (gelegentlich mit einer anderen Länge des Transgens) sowie die gleichen Primer und zeigt die prinzipielle Funktionsfähigkeit der Reaktion an. Dagegen zeigt die Negativkontrolle (meistens ohne Zugabe von DNA) Kontaminationen an. Da keine gereinigte DNA verwendet wird, kann die Anwesenheit von genomischer DNA und zellulärer Proteine zu Fehlbindungen des Primers und somit vermehrt zu falsch positiven Produkten der PCR führen. Die falsch positiven Produkte weisen jedoch meistens eine andere Länge als das gewünschte Produkt auf und lassen sich dann in einer Agarose-Gelelektrophorese unterscheiden.
Anwendungen
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]Die Kolonie-PCR ist eine schnelle Variante der Polymerasekettenreaktion, da direkt Kolonien der Mikroorganismen eingesetzt werden. Sie wird zur Überprüfung der gelungenen Transformation von DNA in die Zellen der Bakterien eingesetzt. Ebenso wird sie zur Identifikation rekombinanter Plasmide verwendet.[3] Ein weiteres Einsatzgebiet ist die Taxonomie, um durch phylogenetische Untersuchungen die Verwandtschaftsverhältnisse der Arten oder Gattungen zu erforschen.[8] Auch im Rahmen der Diagnostik von Krankheitserregern in der Human- und Veterinärmedizin wird die Kolonie-Polymerasekettenreaktion verwendet.[9]
Literatur
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]- Cornel Mülhardt: Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics. Sechste Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2008, ISBN 3-8274-2036-9.
- Bing-Yuan Chen, Harry W. Janes: PCR Cloning Protocols. In: Methods in Molecular Biology, Band 192, Springer 2002, ISBN 9781592591770, S. 130.
- A. R. Pavlov, N. V. Pavlova, S. A. Kozyavkin, A. I. Slesarev: Thermostable DNA Polymerases for a Wide Spectrum of Applications: Comparison of a Robust Hybrid TopoTaq to other enzymes. In: J. Kieleczawa: DNA Sequencing II: Optimizing Preparation and Cleanup. Jones und Bartlett 2006, ISBN 0-7637-3383-0, S. 241–257.
Weblinks
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]- Cornel Mülhardt: Kolonie-PCR. In: Laborjournal online. Abgerufen am 6. Januar 2014.
Einzelnachweise
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]- ↑ M. A. Hofmann, D. A. Brian: Sequencing PCR DNA amplified directly from a bacterial colony. In: BioTechniques. Band 11, Nummer 1, Juli 1991, S. 30–31, ISSN 0736-6205. PMID 1954013.
- ↑ A. C. Ward: Rapid analysis of yeast transformants using colony-PCR. In: BioTechniques. Band 13, Nummer 3, September 1992, S. 350, ISSN 0736-6205. PMID 1389166.
- ↑ a b M. Bergkessel, C. Guthrie: Colony PCR. In: Methods in enzymology. Band 529, 2013, S. 299–309, ISSN 1557-7988. doi:10.1016/B978-0-12-418687-3.00025-2. PMID 24011056.
- ↑ a b H. Packeiser, C. Lim, B. Balagurunathan, J. Wu, H. Zhao: An extremely simple and effective colony PCR procedure for bacteria, yeasts, and microalgae. In: Applied biochemistry and biotechnology. Band 169, Nummer 2, Januar 2013, S. 695–700, ISSN 1559-0291. doi:10.1007/s12010-012-0043-8. PMID 23271627.
- ↑ a b c Tapan Ganguly, Peiqin Chen, Rebecca Teetsel, Lan Ping Zhang, Elias Papaioannou, Joseph Cianciarulo: High-throughput sequencing of high copy number plasmids from bacterial cultures by heat lysis. In: Biotechniques (2005), Band 39, Nummer 3, S. 304–308. PDF ( vom 22. Februar 2014 im Internet Archive).
- ↑ T. J. Kwiatkowski, H. Y. Zoghbi, S. A. Ledbetter, K. A. Ellison, A. C. Chinault: Rapid identification of yeast artificial chromosome clones by matrix pooling and crude lysate PCR. In: Nucleic acids research. Band 18, Nummer 23, Dezember 1990, S. 7191–7192, ISSN 0305-1048. PMID 2263507. PMC 332835 (freier Volltext).
- ↑ A. Ståhlberg, M. Kubista: The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. In: Expert review of molecular diagnostics. Band 14, Nummer 3, April 2014, S. 323–331, ISSN 1744-8352. doi:10.1586/14737159.2014.901154. PMID 24649819. PDF.
- ↑ V. Cattoir, O. Lemenand u. a.: The sodA gene as a target for phylogenetic dissection of the genus Haemophilus and accurate identification of human clinical isolates. In: International journal of medical microbiology : IJMM. Band 296, Nr. 8, Dezember 2006, S. 531–540, ISSN 1438-4221. doi:10.1016/j.ijmm.2006.06.005. PMID 17049306.
- ↑ J. R. Hayes, D. D. Wagner u. a.: Distribution of streptogramin resistance determinants among Enterococcus faecium from a poultry production environment of the USA. In: The Journal of antimicrobial chemotherapy. Band 55, Nr. 1, Januar 2005, S. 123–126, ISSN 0305-7453. doi:10.1093/jac/dkh491. PMID 15574480.