Benutzerin:A doubt/Keimzahlbestimmung

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Ergebnis einer Keimzahlbestimmung: eine Kultur des Bakteriums Serratia marcescens auf einem Nährboden in einer Petrischale

Bei der Keimzahlbestimmung wird in der Mikrobiologie der Gehalt an Mikroorganismen in einer Probe ermittelt, das Ergebnis wird häufig als Keimzahl angegeben. Da die verwendeten Verfahren darauf beruhen, dass die Anzahl der Mikroorganismen auf kulturellem Weg bestimmt wird, werden tatsächlich die durch fortgesetzte Zellteilung entstehen Anhäufungen von Mikroorganismen – die so genannten Kolonien – gezählt. Folglich handelt es sich um die Bestimmung der Anzahl der Koloniebildenden Einheiten (Abkürzung KbE).

Zweck

Im Rahmen der Qualitätssicherung von Lebensmitteln einschließlich Trinkwasser nimmt die Keimzahlbestimmung einen wichtigen Platz ein. Durch diese mikrobiologischen Untersuchungen wird die hygienische Qualität der Produkte überwacht, um den Verderb oder eine geringe Haltbarkeit der Lebensmittel zu verhindern und den Verbraucher vor potenziellen Krankheitserregern zu schützen. Zahlreiche rechtliche Vorgaben enthalten Grenzwerte oder Richtwerte für die Keimzahl bestimmter Mikroorganismen oder für die so genannte Gesamtkeimzahl. So sieht beispielsweise in Deutschland die Trinkwasserverordnung für die Gesamtkeimzahl einen Grenzwert von 100 KbE/mL („Koloniebildende Einheiten pro Milliliter“) bei Trinkwasser vor. Für das Bakterium Escherichia coli erfolgt die Vorgabe, dass diese Indikatororganismen für fäkale Verunreinigungen in 100 mL Wasserprobe nicht nachweisbar sein dürfen.

Vorbereitung der Proben

Ein „Stomacher“, ein Gerät zum Vermischen von Probe und Verdünnungsflüssigkeit

Für alle Bestimmungen des Keimgehaltes ist die Probenahme von erheblicher Bedeutung. Da durch das Ergebnis der Keimzahlbestimmung eine Aussage über die Qualität des gesamten Materials, z. B. des Lebensmittels getroffen wird, müssen die zu bestimmenden Mikroorganismen homogen verteilt sein, damit das Ergebnis der Stichprobe repräsentativ für die Grundgesamtheit ist. Folgich muss das Untersuchungsmaterial gut durchmischt werden, bevor eine Probe entnommen wird. Während dies bei flüssigen Materialien, wie Getränken, relativ einfach erfolgt, ist es bei festen Materialien deutlich schwieriger, so dass hier häufig mehrere Einzelproben entnommen werden, die zu einer Mischprobe vermenngt werden. Da anschließend der Nachweis von Mikroorganismen erfolgt, ist eine Kontamination mit Keimen, die nicht aus dem Untersuchungsmaterial stammen, zu vermeiden. Die Probenahme erfolgt also mit Hilfe von sterilen Werkzeugen und Gefäßen. Weiterhin wird empfohlen, eine große Probemenge von mindestens 50 g als Grundlage für die Untersuchung zu verwenden, damit der mikrobiologische Zustand zuverlässig ermittelt wird.

Die Probe wird dann mit einer sterilen Verdünnungsflüssigkeit vermischt und homogenisiert. Dabei werden flüssige Nährlösungen verwendet, deren Inhaltsstoffe das Überleben der Mikroorganismenzellen sicherstellen sollen, häufig verwendet wird beispielsweise Ringerlösung, Trypton-Kochsalz-Lösung oder 0,9 %ige Kochsalzlösung. Das Verhältnis von Probemenge und Verdünnungsflüssigkeit wird dabei so gewählt, dass später eine einfache Rückrechnung auf den Keimgehalt des untersuchten Materials möglich ist, z.B. durch eine 1:10 Verdünnung, bei der ein Teil Probemenge mit der 9-fachen Menge Verdünnnungsflüssigkeit versetzt wird oder eine 1:5 Verdünnung.

Das Zerkleinern und Homogenisieren erfolgt bei festen Untersuchungsmaterialien mit Hilfe von Schneidmischern und anderen Geräten, die ähnlich wie ein Fleischwolf oder ein Standmixer arbeiten. Für das gleichmäßige Verteilen werden häufig Geräte verwendet, bei denen Mischpaddel von außen auf die in sterilen Kunststoffbeuteln enthaltene Probe in Verdünnungsflüssigkeit einwirken, sie werden als „Stomacher“ bezeichnet (der englische Begriff stomach bedeutet „Magen“, es wird auf die Verteilung von festen und flüssigen Nahrungsbestandteilen im Magen verwiesen). Anders als bei der mechanischen Zerkleinerung durch Mixen erfolgt bei dieser Methode keine Erwärmung durch die zugeführte Energie, was für die mikrobiologische Untersuchung von Vorteil ist, da eine übermäßige Erwärmung zur Abtötung der Zellen führen kann und man folglich Minderbefunde erhalten würde.

Verdünnungsreihe

Schematische Darstellung einer Verdünnungsreihe: 25 g Probe werden mit 225 mL Verdünnungsflüssigkeit vermischt (1:10) und aus dieser Vorverdünnung weitere Verdünnungen hergestellt.

Eine Verdünnungsreihe wird angelegt, wenn in dem Untersuchungsmaterial voraussichtlich so viele Mikroorganismen enthalten sind, dass die Anzahl der Kolonien auf dem Nährmedium zu groß für eine zuverlässige Auswertung ist. In der Praxis üblich ist eine dezimale Verdünnungsreihe, bei der z.B. 1 mL der Probensuspension mit 9 mL Verdünnungsflüssigkeit auf das neue Volumen von 10 mL aufgefüllt wird, also eine 1:10 Verdünnung hergestellt wird. Da die Probensuspension bereits 1:10 verdünnt ist, liegt nun eine 1:100 Verdünnung bezogen auf die ursprüngliche Probe vor. Im nächsten Schritt wird erneut 1 mL der zuvor hergestellten Verdünnung auf 10 mL verdünnt, bezogen auf die ursprüngliche Probe ergibt sich nun eine Verdünnung von 1:1000. Dieses Verfahren führt man fort bis zu einer Verdünnungsstufe, bei der voraussichtlich keine oder nur sehr wenige Mikroorganismen mehr enthalten sind. Die Angabe der Verdünnungsstufe erfolgt üblicherweise als Zehnerpotenz, so bedeutet 10^–3 eine 1:1000 Verdünnung.

Für die Genauigkeit des Ergebnisses ist die korrekte Verdünnung der Probe und die homogene Verteilung der darin vorhandenen Keime von großer Bedeutung. Die Verdünnungsreihe wird oft mit Hilfe von sterilen Reagenzgläsern und sterilen Messpipetten hergestellt. Vor jedem neuen Verdünnungsschritt muss die Suspension erneut durchmischt werden, damit sich die Mikroorganismenzellen gleichmäßig in der Flüssigkeit verteilen. Dabei wird als Hilfsmittel häufig ein Vortexmischer verwendet, der durch Vibrieren den Ansatz im Reagenzglas durchmischt. Falls größere Volumina verdünnt werden sollen, eignen sich dafür Flaschen mit Schraubverschluss, in denen die dezimale Verdünnung mit 10 mL auf 100 mL erfolgen kann.

Plattengebundene Verfahren

Aus den hergestellten Verdünnungsstufen – oder bei einer voraussichtlich geringen Keimzahl direkt aus der flüssigen Probe – wird ein genau abgemessenes Volumen auf ein festes Nährmedium übertragen und verteilt und die darin enthaltenen Mikroorganismen kultiviert. Da das Nährmedium in Petrischalen verwendet wird und diese in der Mikrobiologie vereinfacht als „Platten“ bezeichnet werden, spricht man von plattengebundenen Verfahren. Die Auswahl des Nährmediums hat dabei direkten Einfluss auf das Ergebnis, ebenso wie die weiteren Kultivierungsbedingungen bei denen inkubiert wird.

Zur Bestimmung der Gesamtkeimzahl wird daher ein Vollmedium eingesetzt, um eine möglichst breite Auswahl der verschiedenen enthaltenen Mikroorganismenarten zu kultivieren. Häufig verwendete Nährmedien zu diesem Zweck sind der Standard I Agar oder der Plate Count Agar. Dennoch ist die Bezeichnung „Gesamtkeimzahl“ insofern nicht zutreffend, als dass es keine Kulturbedingungen (wie die Zusammensetzung des Nährmediums, die Bebrütungstemperatur, die Bebrütungsatmosphäre) gibt, unter denen sich alle vorhandenen Mikroorganismen vermehren würden. In den rechtlichen Vorgaben findet sich trotzdem der Begriff der Gesamtkeimzahl (meist ergänzt durch die Angabe der Bebrütungstemperatur) oder die Bezeichnung „Aerobe mesophile Koloniezahl“, darunter fasst man alle Mikroorganismen aus einem Lebensmittel zusammen, die mit Sauerstoff bei mittleren Temperaturen (20–40 °C) auf einem komplexen Nährmedium heranwachsen, also Kolonien bilden. Richtwerte für die Aerobe mesophile Koloniezahl werden durch die Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie veröffentlicht, diese betragen beispielsweise 5 • 10⁶ KbE pro Gramm bei Hackfleisch.

Wenn man die Koloniezahl bestimmter Mikroorganismen bestimmen möchte, verwendet man Selektivmedien, die bestimmte Inhaltsstoffe enthalten, durch die nur das Wachstum von bestimmten Mikroorganismen oder Gruppen von Mikroorganismen ermöglicht wird. Ein gängiges Besipiel ist die Bestimmung der Koloniezahl an Coliformen (als Indikatororganismen für fäkale Verunreinigungen) oder direkt von E. coli. Grenz- und Richtwerte für diese Keimzahlen finden sich in der Trinkwasserverordnung und in zahlreichen EU-Verordnungen. Für diese Untersuchungen wird beispielsweise Endo-Agar oder MacConkey-Agar verwendet.

Für die Übertragung der Probensuspension auf das feste Nährmedium gibt es unterschiedliche Verfahren, dazu zählen das Oberflächenspatelverfahren, das davon abgeleitete, aber vereinfachte Tropfplattenverfahren (drop-plating) und das klassische - von Robert Koch (mit-)erfundene – Plattengussverfahren, welches für alle Keimzahlbestimmungsverfahren als Referenzmethode gilt.

Plattengussverfahren

Diese Methode wird auch als Gussplattenverfahren oder Gusskultur bezeichnet und wurde erstmals von Robert Koch angewendet, der mit dieser mikrobiologischen Technik die Kultivierung und anschließende Untersuchung der Bakterienkolonien ermöglichte. Das für die Untersuchung erforderliche Nährmedium wird in einem Erlenmeyerkolben mit Schliff und darauf aufgesetztem Kippautomaten angesetzt und nach dem Sterilisieren im Autoklaven in einem Wasserbad auf ca. 45 °C temperiert. Falls die Temperatur des Mediums zu hoch ist, können die Keime durch die Hitze geschädigt werden, was zu Minderbefunden führt. Falls die Temperatur des Mediums beim Gießen zu gering ist, bilden sich Klumpen und eine homogene Verteilung der Mikroorganismen ist nicht mehr möglich, was zu Fehlbefunden bei der Auszählung führt. Nun wird mit Hilfe einer sterilen Pipette (Messpipette oder Kolbenhubpipette 1 mL einer Verdünnungsstufe in die Mitte der noch leeren, sterilen Petrischalen pipettiert. In jede einzelne dieser Petrischalen wird 20 mL des noch flüssigen, auf 45 °C temperierten Nährmediums gegossen und die Petrischale sofort in Form einer Acht auf dem Tisch bewegt, damit sich die Probe mit dem Nährmedium homogen vermengt.

Oberflächenspatelverfahren

Eine Kultur des Bakteriums Staphylococcus aureus auf Plate-Count Agar, die bakterienhaltige Suspension wurde zuvor im Spatelverfahren mit einem Drigalskispatel auf dem Nährmedium verteilt.

Diese Methode ist in der Durchführung einfacher, ein weiterer Vorteil ist, dass die benötigten Nährmedien schon vorbereitet werden können. Das Oberflächenspatelverfahren (Abkürzung OSV) – oder auch nur Spatelverfahren oder Spatelplattenverfahren genannt – eignet sich außerdem für die Kultivierung thermolabiler Mikroorganismen, deren Zellen beim Hinzufügen des auf 45 °C temperierten Nährmediums Schaden nehmen können. Bei der üblichen Inkubation im Brutschrank bei Anwesenheit von Luftsauerstoff wachsen jedoch nur aerobe Mikroorganismen.

Zur Vorbereitung wird in sterile Petrischalen jeweils 20 ml eines im Autoklaven sterilisierten Nährmediums gegossen und die Nährmedienplatten anschließend bei 50 °C im Trockenschrank getrocknet. Das Trocknen der Nährbodenoberflächen ist für eine exakte und reproduzierbare Keimzahlbestimmung von besonderer Bedeutung. Trockene Nährbodenoberflächen lassen ein Schwärmen der heranwachsenden Mikroorganismenkolonien nicht zu, die Kolonien können nicht ineinander laufen und lassen sich besser auszählen. Auf die getrockneten Nährmedienplatten werden mit einer sterilen Pipette jeweils 0,1 mL (100 µL) der hergestellten Verdünnungsstufen pipettiert und mit einem abgeflammten Drigalskispatel sofort gleichmäßig auf der Agaroberfläche verteilt, bis die gesamte Flüssigkeit in das Nährmedium eingearbeitet ist, dies wird als „Ausplattieren“ oder „Ausspateln“ bezeichnet. Beim Ausspateln wird die Petrischale gedreht, dabei kann ein Drehtisch als Hilfe verwendet werden. Der Drigalskispatel darf beim Ausplattieren nicht auf die Agaroberfläche gedrückt werden, sondern ist ohne Anpressdruck leicht über die Oberfläche zu bewegen. Vor dem Ausplattieren einer jeden Verdünnungsstufe ist der Drigalski-Spatel in Ethanol zu tauchen, abzuflammen und eine kurze Zeit lang an der Luft abzukühlen, damit nicht unbeabsichtigt Keime von einer anderen Verdünnungsstufe in die nächste Petrischale übertragen werden. Das Auftragen von jeweils 0,1 ml Probensuspension der einzelnen Verdünnungsstufen kann mit nur einer sterilen Pipette erfolgen, wenn zunächst die höchste Verdünnungsstufe (hier 10-6 oder 10-7) und zuletzt die niedrigste Verdünnungsstufe (hier 10-1) pipettiert wird.

Tropfplattenverfahren

Diese Methode wird auch als Plattentropfverfahren oder drop-plating bezeichnet (im englischen Sprachraum auch als „Miles and Misra Method“ bekannt) und stellt eine Vereinfachung des Spatelverfahrens dar. Im Vergleich dazu werden Materialkosten eingespart, da pro Petrischale mit Nährmedium mehrere Verdünnungsstufen aufgetragen werden. Die gut vorgetrockneten Nährbodenplatten werden auf der Unterseite mit einem mit einem wasserfesten Filzschreiber in gleich große, meistens sechs Segmente unterteilt. Die einzelnen Felder werden mit den Verdünnungsstufen der später aufgebrachten verdünnten Proben beschriftet. Von den einzelnen Verdünnungsstufen werden mit einer Kolbenhubpipette 0,02 mL (20 µL) in die Mitte der jeweiligen Segmente getropft. Eine weitere Verteilung erfolgt nicht, es wird 15 bis 20 Minuten gewartet, bis der Tropfen getrocknet ist, die Flüssigkeit also in das Nährmedium eingezogen ist.

Spiralplattenverfahren

Diese Methode zeichnet sich durch die Automatisierung der Durchführung aus.

Literatur

• Susan Isaac, David Jennings: Kultur von Mikroorganismen. Spektrum Akad. Verlag, Heidelberg 1996, ISBN 3-8274-0049-X. Übersetzung der englischsprachigen Ausgabe mit dem Titel Microbial culture.
• Eckhard Bast: Mikrobiologische Methoden: Eine Einführung in grundlegende Arbeitstechniken. 2. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg/Berlin 2001, ISBN 978-3-8274-1072-6.