Diskussion:Patch-Clamp-Technik

Bilder

Wären Bilder von gepatchten Zellen interessant? Ich könnte welche hochladen wenn Interesse besteht. CHO mit GFP cotransfiziert Hellfeld/Floureszenz (nicht signierter Beitrag von 88.68.186.4 (Diskussion | Beiträge) 22:34, 14. Apr. 2010 (CEST))

Danke fürs Angebot. Um ehrlich zu sein, wäre mir ein gutes Foto eines Messplatzs, auf dem die wesentliche Elemente gut zu erkennen sind, erheblich lieber als eine weitere Sammlung grünleuchtender Boppeln ;-) Auch gegen ein Foto eines Pullers oder einer Microforge (am liebsten im Einsatz) wäre nichts einzuwenden. Das muss Dich natürlich nicht abhalten, auch GFPs (Green Fluorescing Photographs) einzustellen. Wenn die Pipettenspitze gut zu erkennen ist, wären auch diese ein Gewinn. --Burkhard 14:31, 18. Apr. 2010 (CEST)

Unverständlich

leider erfährt man hier gar nicht, um was es geht. --Gunter Krebs Δ 13:10, 25. Jan 2005 (CET)

VERSUCH EINER ERKLÄRUNG

Patch-Clamp auf deutsch lässt sich eher verstehen, wenn man etwas in die Geschichte der Elektrophysiologie schaut. Ein frühes Ziel war es, elektrische Spannungen über Membranen zu messen, die Zellen umgeben. Dazu wurden mit KCl-Lösung elektrisch leitend gemachte Glaskanülen (Mikropipetten) in die Zelle gestochen. Dabei entspricht die leitende Füllung der Pippette dem Draht in einem Kabel und das Glas der Pippette einer Isolierung. Um die Membran nicht unnötig zu verletzen, müssen die Mikropipetten sehr dünn sein (typisch 1 µm), mit der Folge, dass der Pipettenwiderstand sehr hoch (einige MOhm) ist, und das Spannungsmessgerät einen noch viel höheren Eingangswiderstand erfordert, was inzwischen ganz leicht zu realisieren ist. Das nächste, zu lösende Problem bestand in der korrekten Messung des Membranwiderstands, der meist kleiner ist als der Pipettenwiderstand. Würde man naiv nach dem Ohm'schen Gesetz vorgehen, und mit der eingestochenen Mikropipette nicht nur die Spannung messen, sondern auch den durch sie fließenden Strom, würde hauptsächlich der Pipettenwiderstand als Artefakt erscheinen, weil dem gegenüber der gesuchte Membranwiderstand verschwindet.

Die Lösung des Problems war Voltage-Clamp, eine Rückkoppelungsschaltung mit zwei Mikropipetten, wobei mit der einen die Membranspannung gemessen wird (s.o.) und mit einer Sollspannung verglichen, und mit der zweiten soviel (zu messender) Strom injiziert wird, dass sich Soll- und Ist-Spannung gleichen. Auf deutsch könnte man von Spannungshomöostasie, von Potentiostasie oder (wenn die Spannung nicht konstant sein soll sondern einem vorgegebenen, zeitlichen Protokoll folgen soll) von Spannungsfolge durch Rückkoppelung reden, was sich gegenüber dem einprägsamen, englischen Laborjargon Voltage-Clamp nie durchsetzen konnte. Es handelt sich also um eine Technik, mit der man trotz hoher Pipettenwiderstände die Membranströme ( = Clamp-Strom durch die Strompipette) bei wohldefinierter Membranspannung messen kann. Gelegentlich wird in deutschen Texten das Clamp buchstäblich mit 'Klemme' wiedergegeben, was sonst nirgends in der Physik für 'feedback control' geschieht. Dadurch wird der falsche Eindruck erweckt, Klemme gäbe es nur in der Elektrophysiologie.

In der praktischen Anwendung von Voltage-Clamp ergab sich das Problem, dass die durch den Experimentator vorgegebene Spannung streng genommen nur an einem Punkt des zu untersuchenden Objekts eingehalten wird, nämlich an der Spitze der eingestochenen Spannungspipette, was man kurz als Point-Clamp (eigentlich point voltage clamp) bezeichnete im Gegensatz zur gewünschten Spannungshomöostase über ein wohldefiniertes Membranareal, das man - wieder nicht ganz korrekt aber griffig - Space-Clamp nannte.

Eingeweihte haben daher unter Patch-Clamp sofort verstanden, dass es sich um Spannungshomöostase an dem kleinen Membranareal handelt, mit dem die leitende Füllung der sonst isolierenden Mikropipette mit der Zellmembran in elektrische Verbindung tritt, wenn die Mikropippette dicht auf der Membran aufsitzt. Es kursieren Versuche, in diesem Zusammenhang auch Patch einzudeutschen: Fetzen passt nicht so recht, weil es an schlecht-definierte Abgrenzung denken lässt; Fleck bzw. Flecken impliziert zu sehr Textiles oder Schmutz, und Flicken Reparatur. Jedenfalls wird ein gebildeter Laie Fleckenklemme mit allem Möglichen assoziieren, nur nicht mit Spannungshomöostase über ein kleines Membranareal.

Einer von vielen Vorteilen der Patch-Clamp-Technik besteht darin, dass man nicht mehr zwei Elektroden braucht, um Stromänderungen bei vorgegebenen Spannungsänderungen zu verfolgen; denn der elektrische Widerstand des untersuchten Membranareals ist jetzt typischerweise viel größer als der Pipettenwiderstand. Spannungshomöostase am Patch erfordert also gar keine extra Stromelektrode. Der Vergleich zwischen Ist- und Soll-Spannung findet weitab vom Patch im Patch-Clamp-Verstärker statt. Dies Gerät wird kurz Verstärker genannt, obwohl seine Hauptaufgabe nicht in der Verstärkung von Signalen besteht, sondern in deren Verarbeitung.

Noch was zum Fachjargon: Bei der Patch-Clamp-Technik unterscheidet man eine Reihe von Konfigurationen (siehe Artikel), die allesamt eine erfolgreiche Abdichtung zwischen dem Glas der Pipettenspitze und der Zellmembran (Gigaseal = Elektrischer Widerstand zwischen Pipetteninnerem und Bad im Gigaohm-Bereich) erfordern:

1. Cell attached wie oben kurz beschrieben (Nachteil: die gemessene Spannung beinhaltet auch die Membranspannung außerhalb des Patches).

2. Excised patch: beschriebene Mikromembranareale, isoliert vom Rest der Zellmembran.

a) Inside-out: Nach einfachem Abziehen des beschriebenen Mikromembranareals vom Rest der Zelle weist die ursprünglich zytoplasmatische Membranseite zum Bad.

b) right-side-out: nach einer etwas schwierigeren Prozedur weist die ursprünglich externe Membranseite zum Bad.

3. Whole-cell: Hier wird nach Ausbildung des Gigaseals das Mikromembranareal zerstört, so dass die leitende Füllung der Pipette mit dem gesamten Zellinneren in gutem elektrischen Kontakt steht, und Ströme über die gesamte Zellmembran gemessen werden. Das gelingt bei kleinen Zellen, deren Gesamtmembranwiderstand deutlich größer als der Pipettenwiderstand. Man spricht dann eigentlich besser von High-Seal -Technik; das schlampigere Patchen hat sich aber auch hier eingebürgert. Die Whole-Cell-Konfiguration wird also auch als Patch-Clamp-Technik verstanden, obwohl sie sich ironischerweise dadurch auszeichnet, dass das kritische Mikromembranareal an der Pipettenspitze zerstört wird, und die gemessenen Ströme die gesamte Membranfläche repräsentieren, ausgenommen den Patch. Wenn also jemand wie Zsynth unten behauptet, er patche gewisse Zellen, dann meint er damit, er führe eine elektrische Charakterisierung der Zellmembran durch, indem er die Whole-Cell-Konfiguration zur Strommessung unter Spannungshomöostase benutzt.

Die Konfigurationen 1 und 2 eignen sich - im Gegensatz zu älteren Methoden - zur elektrischen Charakterisierung einzelner, elektrisch (hinreichend) leitender Moleküle in einem winzigen Membranareal - und stellen damit eine fundamentale Neuerung in der Elektrophysiologie dar (Stichwort Einzelkanalmessungen). Dagegen bietet Konfiguration 3 nur qualitative Vorteile gegenüber herkömmlichen, elektrophysiologischen Techniken.

Zusammenfassend auf die Frage, worum es bei Patch-Clamp eigentlich geht: Elektrophysiologische Charakterisierung von Zellmembranen, ja sogar einzelnen Molekülen elektrisch leitender Membranproteine durch eine spezielle Technik, bei dem die offene Spitze einer innen leitenden Mikropipette in besonders engen Kontakt mit der zu untersuchenden Lipidmembran gebracht wird. Wird das winzige Membranareal unter der Pipettenspitze (Patch) untersucht, sind mikroskopische Messungen an einzelnen leitenden Molekülen möglich. Wird der Patch zerstört, eignet sich das Präparat zu konventioneller Untersuchung makroskopischer Membranströme im Whole-Cell-Modus. -- Solfiz 16:59, 16. Jul. 2011 (CEST)

soweit ich weiß, wird diese Technik nur/hauptsächlich bei Nervenzellen angewandt, stimmt das? Im Artikel wird es bisher nicht erwähnt... --Pinguin.tk 19:37, 25. Jan 2005 (CET)

Nein, die Technik hat einen viel weiteren Anwendungsbereich. -- Solfiz 16:59, 16. Jul. 2011 (CEST)

Das weiß ich nicht. Ich habe dazu nur ein kurzes Kapitel in einem Buch gelesen und da stand nichts davon. --Nematocera 18:59, 26. Jan 2005 (CET)

Nein, das stimmt nicht. Ich selber patche Makrophagen und Monozyten. Im Grunde ist jede Zelle mit spannungsabhängigen Ionenkanälen zu patchen, es gibt auch Publikationen über Glia-Zellen und Osteoklasen (die ja zu den Makrophagen gehören.). Andere Zellen sind elektrophysiologisch eher uninteressant, zu patchen (z.B. um für weitere Analysen das Cytoplasma auszusaugen) sind sie aber auch. Bei Fragen stehe ich gern zur Verfügung. lg--Zsynth 13:40, 28. Okt 2005 (CEST)

Naja, ich denke nicht, daß die Patch Clamp-Untersuchungen beispielsweise von Kardiomyozyten und Skelettmuskelzellen "uninteressant" ist - die Massen an einschlägiggen Publikationen dazu sprechen dazu ihre eigene Sprache... -- Spunkt 20:12, 16. Jun. 2007 (CEST)

Na klar, die roten Clamper ahnen noch nicht mal etwas von ihren grünen Kollegen, als ob Pflanzenzellen keine Ionenkanäle hätten. Im übrigen muß bei gekoppeltem Transport der eigentliche Transporter gar kein Ionenkanal im eigentlichen Sinne sein. -- Burkhard 21:39, 15. Nov. 2007 (CET)

Bei gekoppeltem Transport kann man bislang den fundamentalen Vorzug von Patch-Clamp leider nicht ausnutzen, der da heißt Charakterisierung einzelner Transportermoleküle; denn gekoppelte Transporter sind mit einem Umsatz von < MHz zu langsam verglichen zu vielen Kanälen. Übrigens finde ich den Ausdruck gekoppelter Transport hier ausgesprochen treffend; denn im Gegensatz zu typischen Kanälen, die man als Uniporter auffassen kann, beinhaltet gekoppelter Transport sowohl Cotransporter, bei denen der Transport eines Substrats an den Transport eines weiteren Substrats gekoppelt ist (mit den logischen Unterkategorien Symporter und Antiporter) als auch Ionenpumpen, bei denen der Transport einer Ionenspezies an eine Stoffwechselreaktion gekoppelt ist. Beide Koppelungstypen sind in der Na/K-ATPase realisiert.

Wenn man ganz streng sein will, ist Uniport ein theoretischer Sonderfall; denn reale Kanäle haben keine perfekte Selektivität sondern entsprechen Antiportern (mit nicht-perfekter Koppelung), sobald ein konkurrierendes, transportables Substrat mit ins Spiel kommt. Wenn es nicht transportabel ist erscheint es als Blocker auf Kanalogisch oder kompetitiver Inhibitor auf Enzymologisch. -- Solfiz 16:59, 16. Jul. 2011 (CEST)

Planar Patch Clamp

Wieso sind eigentlich die Bilder dieselben, die man auf der Nanion-Homepage bewundern kann? Nutzt Automated-Patch-Clamp diese Seite für Werbung? G.--Zsynth 10:54, 15. Aug 2006 (CEST)

Ich habe leider keine anderen Bilder, die ich verwenden kann. Ich denke die schematischen Abbildungen stellen auch nur das Prinzip dar ohne Werbung zu sein. Beim Größenvergleich handelt es sich beim planaren System tatsächlich um ein Produktfoto - es könnte auch ein beliebiges anderes System abgebildet werden - leider sind aber alle kommerziell bei den verschiedenen Firmen erhältlich (Molecular Devices, Sophion, Cytocentrics). (Automated Patch Clamp)

Ich denke, daß das Planare Patch Clamp, welches trotz aller Fortschritte ja immer noch eher ein Nischendasein führt, Anteilsmäßig in diesem Artikel völlig überrepräsentiert ist. Es m.W. erlaubt auch viele der Manipulationsmöglichkeitne des konventionellen Patch Clamps auch gar nicht (Outside Out Patch usw.). Die fraglichen Bilder tragen rein gar nichts zum Verständnis der Methode bei. Gekoppelt mit dem ebenfalls nur bedingt informativen Link riecht das für mich schon nach Product Placement. (Zumal sie aus dem Produktkatalog stammen, aber von User "Automated Patch Clamp" unter der GNU-Lizenz freigegeben wurden, der Rechtehalter des Produkkatalogs also anscheinende auch derjenige ist, der sie hier reingestellt hat...) Ich habe mir erlaubt, beide zu entfernen. -- Spunkt 20:12, 16. Jun. 2007 (CEST)

Stärkere Untergliederung - bessere Lesbarkeit

Hallo, ich denke für eine bessere Lesbarkeit sollte die Seite wesentlich stärker untergliedert werden:

==Anwendungsgebiete==

Hier gehört rein, daß PC Messungen an tierischen- und pflanzlichen Zellen (nach Protoplastierung, kann ich was dazu schreiben) durchgeführt werden können, daß individuelle Ionenkanäle aufgelöst werden können und daß die meßbaren Ströme im Bereich von wenigen pA liegen. Es sollten auch Beispiele genannt werden, wo der Einsatz der PC-Technik wesentlich zu neuen Ergebnissen beigetragen hat. Am Anfang vielleicht erwähnenswert, daß es sich um eine Weiterentwicklung Voltage-Clamp Technik handelt, die in der Neurophysiologie eingesetzt wurde/wird.

==Material und Geräte==

Eine kurze Beschreibung des PC-Arbeitsplatzes (Verstärker, schwingungsgedämpfter Tisch, inverses Mikroskop, Mikromanipulatoren). Ziehen und Füllen der Glaspipetten. Hinweis darauf, daß PC eine aufwendige Technik ist und dem Experimentator ein hohes Maß an handwerklichem Geschick abverlangt. BTW, das Gigaseal kommt nicht durch Unterdruck zustande, soweit ich weiß, ist der Prozess der zum Gigaseal führt, noch nicht vollständig verstanden, manchmal kommt es auch zu spontanen Seals.

==Patch-Konfigurationen==

Das ist z.Zt der Hauptteil. Es fehlt noch die OO-Konfiguration und schön wäre eine vierteilige Graphik, die zeigt, wie man von der CAP zu den anderen Konfiguration gelangt. Sowas findet sich fast in jeder PC-Doktorarbeit, sollte sich eigentlich auftreiben lassen.

==Weiterentwicklungen==

und darf jetzt auch die

===Planar patch clamp== auftauchen

Danach geht es wie üblich weiter:

==Quellen== ... -- Burkhard 17:24, 17. Nov. 2007 (CET)

Meine Erfahrung ist, dass ich, nachdem ich die Technik einem Laien erklärt habe fast immer verwundert gefragt werde, wozu das gut sein soll. Daher scheint es mir angemessen, in ein zwei Sätzen die Bedeutung von Ionenkanälen in Biologie und Medizin (zum Beispiel in der Pharmakologie) zu erwähnen.

Bean, 1970 & Steven Hladky, Denis Haydon, 1972.

Hallo, im Artikel finden sich zwei Quellenangeben die nicht (eindeutig) zuordbar sind.

Bean, 1970

• Hier finde ich garnichts

Steven Hladky, Denis Haydon, 1972. Hier gibt es mehrere Publikationen der beiden Autoren, geht man davon aus, dass das Veröffentlichungsjahr stimmt könnte es einer dieser Artikel sein

• S. B. Hladky, D. A. Haydon: Ion transfer across lipid membranes in the presence of gramicidin A:: I. Studies of the unit conductance channel. In: Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 274. Jahrgang, Nr. 2, 1972, S. 294–312. 
• V. B Myers, D. A. Haydon: Ion transfer across lipid membranes in the presence of gramicidin A:: II. The ion selectivity. In: Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 274. Jahrgang, Nr. 2, 1972, S. 313–322. 
• D. A. Haydon, S. B. Hladky: Ion transport across thin lipid membranes: a critical discussion of mechanisms in selected systems. In: Quarterly Reviews of Biophysics. 5. Jahrgang, Nr. 02, 2009, S. 187–282. 
• D. A. Haydon, S. B. Hladky, L. G. M. Gordon: The Single Channel Technique in the Study of Ion Transfer Across Membranes. In: Fed. Europ. Biochem. Soc., Mitochondria/Biomembranes. 28. Jahrgang, 1972. 

Klarheit kann aber nur Benutzer:Drahkrub geben, der die Information in den Artikel eingebaut hat ([1]). --Cepheiden 08:32, 15. Apr. 2010 (CEST)

Nö, kann er eigentlich auch nicht, denn die Angabe in genau dieser Knappheit aus der verwendeten Literatur "M. Numberger , A. Draguhn: Patch-Clamp Technik. Spektrum Akademischer Verlag, 1996"; dort werden Neher und Sakmann zitiert, dass sie zwei faszinierende Artikel von Bean und Haldy & Haydon gelesen hätten. Tatsächliche Aufklärung bringt hier der Nobelpreisvortrag von Erwin Neher:

• Bean, R.C., Shepherd, W.C., Chan, H., & Eichler, J.T. (1969) J. Gen. Physiol. 53,

741-757.

• Hladky, S.B. & Haydon, D.A. (1970) Nature 225, 451-453.

--Burkhard 14:09, 18. Apr. 2010 (CEST)

Dann wäre es aber besser "M. Numberger , A. Draguhn: Patch-Clamp Technik. Spektrum Akademischer Verlag, 1996"; zu zitieren als deren (schlechte) Zitation zu übernehmen. nunja, wenn wir jetzt etsprechende Artikel haben, ist es ja auch gut. --Cepheiden 14:31, 18. Apr. 2010 (CEST)

Da hast Du schon recht, aber ich war noch wikijung und brauchte die Edits ;-) --Burkhard 15:00, 18. Apr. 2010 (CEST)

Permeabilität

"Da die Trägersubstanz von Biomembranen, die Lipiddoppelschicht, für Wasser und gelöste Ionen praktisch undurchlässig ist,"

Stimmt das denn? Meines Wissens ist die Membran für Wasser ziemlich gut durchlässig, weil die Moleküle zwar polar, aber sehr klein sind. (nicht signierter Beitrag von 87.183.39.79 (Diskussion) 17:38, 16. Jan. 2011 (CET))

Dann solltest Du Deine Kenntnisse mal auffrischen - und auch noch genauer lesen, der Satz macht eine Aussage über die Lipiddoppelschicht - das ist noch keine Biomembran - und warum sollte die Lipiddoppelschicht für polare Moleküle durchlässig sein? Es geht ja genau darum, dass die Durchlässigkeit der Membran für polare Moleküle und Ionen von darin befindlichen Ionenkanälen und Transportproteinen abhängt. -- Burkhard 20:49, 16. Jan. 2011 (CET)

Messung der Membrankapazität

@Benutzer:Synapse: Die Zellmembran ist mitnichten ein statischer Kondensator, sie ist elektrisch leitend (im Unterschied zur reinen Lipiddoppelschicht). Art sowie Umfang der Leitfähigkeit hängen vom Milieu und somit vom Zustand der Ionenkanäle ab. Sorry, bitte eine Deiner hundert Quellen bemühen und die Messung der Membrankapazität ausreichend ausführlich darstellen - so ist das zu verkürzt. Gruß, Burkhard