Polyhistidin-Tag
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Ein Polyhistidin-Tag (synonym His-Tag, Hexahistidin-Tag, His6-Tag) ist ein Protein-Tag, das zur Proteinreinigung und zum Nachweis markierter Proteine verwendet wird.[1]
Eigenschaften
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]Die Aminosäuresequenz des Polyhistidin-Tags ist eine Folge von mindestens sechs Histidinen, deren Gensequenz N-terminal nach dem Start-Methionin-Codon oder C-terminal vor das Stopcodon in das offene Leseraster eines Gens kloniert wird.[2] Dadurch entsteht ein Fusionsprotein mit einem Polyhistidin-Tag. Gelegentlich wird eine Schnittstelle für eine Protease oder ein Intein zwischen Protein und Polyhistidin-Tag eingefügt, um eine Abspaltung des Tags nach einer Proteinreinigung zu ermöglichen.
Das Polyhistidin-Tag bindet mit mikromolarer Affinität an zweiwertige Nickel- oder Cobalt-Ionen und bildet einen Chelatkomplex. Werden die Ionen durch Bindung an einen Feststoff-gekoppelten Chelator immobilisiert, können die Proteine mit Polyhistidin-Tag in einer Affinitätschromatographie (genauer: in einer Metall-Chelat-Affinitätschromatographie) selektiv gebunden werden und durch Spülen der Säule mit 20 mM Imidazol von den ungebundenen Proteinen befreit werden.[3] Ernst Hochuli koppelte 1987 den NTA-Liganden an Agarose-Kügelchen um Proteine damit aufzureinigen.[4] Diese Agarose wird als Säulenbett wird meistens Nitrilotriessigsäure-Agarose (Ni-NTA-Agarose), seltener auch Ni2+-Iminodiessigsäure-Agarose (Ni-IDA-Agarose) oder Co2+-Carboxymethylaspartate-Agarose (Co-CMA-Agarose) verwendet. Die Elution der gebundenen Proteine erfolgt mit einem Puffer, der 75 bis 300 mM Imidazol, einen sauren pH-Wert (pH 4 für Nickel-Agarosen und pH 6 für Cobalt-Agarosen) oder Nickel- oder Cobaltionen enthält. Störsubstanzen sind EDTA, manche Tenside und Reduktionsmittel (z. B. aus dem Probenpuffer). Nach der Elution wird das Imidazol meistens durch Dialyse oder Gelfiltration entfernt.
An die Nickel-basierten Säulenmaterialien bindet auch die Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerasen vom FKBP-Typ (SlyD, 25kDa) aus E. coli. Daher wird oftmals eine Tandem-Affinity-Purification zur weiteren Reinigung verwendet.[5] Es gibt auch SlyD-defiziente Bakterienstämme. Cobalt-CMA-Agarose bindet SlyD schwächer.
Durch eine serielle Verwendung von mehreren Polyhistidin-Tags können Proteine mit zunehmender Anzahl bei zunehmender Imidazol-Konzentration nacheinander eluiert werden. Dadurch können mehrere Proteine mit unterschiedlicher Hexahistidin-Anzahl gleichzeitig gereinigt und bei steigenden Imidazol-Konzentrationen nacheinander eluiert werden.[6]
Anwendungen
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]Polyhistidin-Tags werden zur Reinigung rekombinanter Proteine per Affinitätschromatographie, für Pulldown-Assays und – bei Verwendung von Anti-Polyhistidin-Tag-Antikörpern – für Methoden mit einer Immunmarkierung (z. B. ELISA, Western Blot, Immunfluoreszenz, Immunhistochemie und Durchflusszytometrie) verwendet. Es gibt selektiv bindende Fluoreszenzfarbstoffe.[7] Ein Protein mit Polyhistidin-Tag kann auf Nickel- oder Cobalt-Oberflächen immobilisiert werden oder in Nickel-haltigen Membranen adsorbiert werden.[8]
Einzelnachweise
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]- ↑ E. Hochuli, W. Bannwarth, H. Döbeli, R. Gentz, D. Stüber: Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. In: Nature Biotechnology. 6, 1988, S. 1321, doi:10.1038/nbt1188-1321.
- ↑ K. J. Petty: Metal-chelate affinity chromatography. In: Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. Chapter 5Mai 2001, S. Unit 5.10, doi:10.1002/0471142301.ns0510s05. PMID 18428493.
- ↑ P Hengen: Purification of His-Tag fusion proteins from Escherichia coli. In: Trends in Biochemical Sciences. 20. Jahrgang, Nr. 7, 1995, S. 285–6, doi:10.1016/S0968-0004(00)89045-3, PMID 7667882.
- ↑ E. Hochuli, H. Döbeli, A. Schacher: New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. In: Journal of Chromatography A. Band 411, Nummer , 1987, S. 177–184, doi:10.1016/S0021-9673(00)93969-4.
- ↑ A. C. Gavin, M. Bösche, R. Krause, P. Grandi, M. Marzioch, A. Bauer, J. Schultz, J. M. Rick, A. M. Michon, C. M. Cruciat, M. Remor, C. Höfert, M. Schelder, M. Brajenovic, H. Ruffner, A. Merino, K. Klein, M. Hudak, D. Dickson, T. Rudi, V. Gnau, A. Bauch, S. Bastuck, B. Huhse, C. Leutwein, M. A. Heurtier, R. R. Copley, A. Edelmann, E. Querfurth, V. Rybin, G. Drewes, M. Raida, T. Bouwmeester, P. Bork, B. Seraphin, B. Kuster, G. Neubauer, G. Superti-Furga: Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. In: Nature. Band 415, Nummer 6868, Januar 2002, S. 141–147, doi:10.1038/415141a. PMID 11805826.
- ↑ Mark Howarth, Daniel J-F Chinnapen, Kimberly Gerrow, Pieter C Dorrestein, Melanie R Grandy, Neil L Kelleher, Alaa El-Husseini, Alice Y Ting: A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site. In: Nature Methods. 3. Jahrgang, Nr. 4, 2006, S. 267–73, doi:10.1038/nmeth861, PMID 16554831, PMC 2576293 (freier Volltext).
- ↑ C Zhao, LM Hellman, X Zhan, WS Bowman, SW Whiteheart, MG Fried: Hexahistidine-tag-specific optical probes for analyses of proteins and their interactions. In: Analytical Biochemistry. 399. Jahrgang, Nr. 2, 2010, S. 237–45, doi:10.1016/j.ab.2009.12.028, PMID 20036207, PMC 2832190 (freier Volltext).
- ↑ J. Zhu, G. Sun: Facile fabrication of hydrophilic nanofibrous membranes with an immobilized metal-chelate affinity complex for selective protein separation. In: ACS applied materials & interfaces. Band 6, Nummer 2, Januar 2014, S. 925–932, doi:10.1021/am4042965. PMID 24377297.