Protection Assay

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Ein Protection Assay (zu deutsch Schutzversuch) bezeichnet eine biochemische Methode zur Bestimmung geschützter und somit für Enzyme, Chemikalien oder Markierungen unzugänglicher Molekülstrukturen.

Prinzip

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Beim Protection Assay werden Biomoleküle einer Behandlung unterzogen, beispielsweise der Inkubation mit einem Enzym. Der Protection Assays beruht auf der geringeren Zugänglichkeit abgedeckter Molekülbereiche. So kann das zu untersuchende Molekül unterschiedlichen Bedingungen (z. B. Inhibitoren, denaturierende Temperaturen, Salze, Vernetzer) unterworfen werden. Der Vergleich zur Negativkontrolle erlaubt Rückschlüsse auf eine entsprechende Veränderung. Das Biomolekül kann auch zum Nachweis einer Interaktion mit einem weiteren Molekül inkubiert werden. Die veränderte Zugänglichkeit erlaubt in diesem Fall Hinweise auf eine Bindung und gegebenenfalls auch auf die Bindungsstelle.

Proteine

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Bei Proteinen werden z. B. in einem limited proteolysis assay (synonym protease exclusion assay) verschiedene Proteasen zum Abbau zugänglicher Proteinstrukturen verwendet.[1][2] Durch die Proteinfaltung des abzubauenden Proteins können manche Proteasen nur dessen oberflächennahe Bereiche abbauen.[3] Insbesondere Proteasen mit einem weniger exponierten (d. h. tiefer liegenden) aktiven Zentrum können räumlich bedingt nur ungefaltete Bereiche ihres Substrats abbauen. Mit einer Veränderung der Temperatur kann die Thermostabilität eines Proteins untersucht werden, da bei Erhöhung der Temperatur das Protein entfaltet wird. Dies ist eine Variante des Thermal Shift Assays. Wichtige Erkenntnisse erlaubt die limitierte Proteolyse auch nach Ligandenbindung. So erlaubt die veränderte Zugänglichkeit nach der Inkubation nukleärer Rezeptoren mit dem spezifischen Hormon oder mit einer DNA-Zielsequenz, Hinweise auf allosterische Veränderungen.[4][5]

DNA

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Nukleinsäuren werden z. B. zur Untersuchung von Nukleosomen einem nuclease protection assay oder zur Untersuchung von spezifischen Protein-DNA-Interaktionen einem DNAse Footprinting Assay unterzogen.[6][7] So sind z. B. um Histone gewickelte DNA-Stränge oder von DNA-bindenden Proteinen bedeckte DNA-Sequenzen für manche Nukleasen nicht zugänglich, während ungebundene DNA-Abschnitte abgebaut werden können. Dadurch zeigt sich z. B. bei Nucleosomen in einer Agarose-Gelelektrophorese nach einem teilweisen Abbau der DNA eine DNA-Leiter. Die Bindungsequenzen können auch durch Inkubation von Protein-DNA-Komplexen mit Exonukleasen identifiziert werden.

RNA

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In einem RNase protection assay werden RNA mit spezifisch bindenden RNA-Hybridisierungssonden vor einem Abbau durch Einzelstrang-abbauende RNasen geschützt.[8] Dadurch kann ein Transkriptionsstartpunkt identifiziert werden.[9][8] Ein RNase protection assay kann zum Schutz eines Moleküls bei einer RNA-Reinigung unter Verdau aller weiteren RNA-Moleküle anderer Sequenz verwendet werden.[10] Durch die Abwesenheit anderer RNA-Sequenzen sinkt die Nachweisgrenze bei einer RT-PCR, weil die Spezifität der Primerbindung erhöht wird.[11]

DNA/RNA

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Ein klassisches Verfahren der Molekularbiologie ist der S1-Assay.[12] Bei dieser Methode zur Untersuchung von DNA-RNA-Hybriden bedient man sich der einzelstrangspezifischen Nuclease S1 aus Aspergillus oryzae.[13] In einem DNA-RNA Hybrid schneidet S1 die nicht hybridisierten einzelsträngigen Abschnitte an den Enden des Hybrids. Das Ergebnis ist ein vollständig doppelsträngiges Hybrid. Bei der Untersuchung verwendet man am 5'-Ende radioaktiv markierte DNA, die z. B. den Transkriptionsstart eines Gens umfasst. Zur Größenanalyse trennt man die geschützte DNA mit einem Größenmarker oder der Sequenzreaktion der DNA-Probe auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel auf.

Einzelnachweise

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  1. ↑ S. R. Nirantar, X. Li, J. W. Siau, F. J. Ghadessy: Rapid screening of protein-protein interaction inhibitors using the protease exclusion assay. In: Biosensors & Bioelectronics. [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] Januar 2014, ISSN 1873-4235. doi:10.1016/j.bios.2013.12.060. PMID 24508816.
  2. ↑ R. S. Jamison, M. E. Newcomer, D. E. Ong: Detection of conformational changes in cellular retinoid-binding proteins by limited proteolysis. In: Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). Band 89, 1998, S. 165–176, ISSN 1064-3745. doi:10.1385/0-89603-438-0:165. PMID 9664327.
  3. ↑ A. Fontana, P. P. de Laureto, B. Spolaore, E. Frare, P. Picotti, M. Zambonin: Probing protein structure by limited proteolysis. In: Acta biochimica Polonica. Band 51, Nummer 2, 2004, S. 299–321, ISSN 0001-527X. PMID 15218531. PDF.
  4. ↑ S. Suzuki, S. Nishida, K. Ohno, T. Santa: Modulation of coactivator recruitment by cooperative ligand binding to human Estrogen receptor alpha and beta. In: Biological & pharmaceutical bulletin. Band 30, Nummer 9, September 2007, S. 1641–1647, PMID 17827713.
  5. ↑ J. Brodie, I. J. McEwan: Intra-domain communication between the N-terminal and DNA-binding domains of the androgen receptor: modulation of androgen response element DNA binding. In: Journal of molecular endocrinology. Band 34, Nummer 3, Juni 2005, S. 603–615, doi:10.1677/jme.1.01723, PMID 15956332.
  6. ↑ A. Vora, D. P. Grandgenett: DNase protection analysis of retrovirus integrase at the viral DNA ends for full-site integration in vitro. In: Journal of virology. Band 75, Nummer 8, April 2001, S. 3556–3567, ISSN 0022-538X. doi:10.1128/JVI.75.8.3556-3567.2001. PMID 11264345. PMC 114847 (freier Volltext).
  7. ↑ M. Mizuuchi, T. A. Baker, K. Mizuuchi: DNase protection analysis of the stable synaptic complexes involved in Mu transposition. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 88, Nummer 20, Oktober 1991, S. 9031–9035, ISSN 0027-8424. PMID 1656459. PMC 52645 (freier Volltext).
  8. ↑ a b M. F. Carey, C. L. Peterson, S. T. Smale: The RNase protection assay. In: Cold Spring Harbor protocols. Band 2013, Nummer 3, März 2013, S. , ISSN 1559-6095. doi:10.1101/pdb.prot071910. PMID 23457339.
  9. ↑ A. Sandelin, P. Carninci, B. Lenhard, J. Ponjavic, Y. Hayashizaki, D. A. Hume: Mammalian RNA polymerase II core promoters: insights from genome-wide studies. In: Nature Reviews Genetics. Band 8, Nummer 6, Juni 2007, S. 424–436, ISSN 1471-0056. doi:10.1038/nrg2026. PMID 17486122.
  10. ↑ A. D. Paradh, A. E. Hill, W. J. Mitchell: Detection of beer spoilage bacteria Pectinatus and Megasphaera with acridinium ester labelled DNA probes using a hybridisation protection assay. In: Journal of microbiological methods. Band 96, Januar 2014, S. 25–34, ISSN 1872-8359. doi:10.1016/j.mimet.2013.10.014. PMID 24184310.
  11. ↑ H. A. Young, J. J. Subleski, S. M. Krebs: Multiprobe ribonuclease protection assay for simultaneous measurement of mRNA expression. In: Current protocols in immunology / edited by John E. Coligan ... [et al.]. Chapter 10August 2003, S. Unit 10.29, ISSN 1934-368X. doi:10.1002/0471142735.im1029s54. PMID 18432896.
  12. ↑ F. Gannon, J. M. Jeltsch, F. Perrin: A detailed comparison of the 5'-end of the ovalbumin gene cloned from chicken oviduct and erythrocyte DNA. In: Nucleic acids research. Band 8, Nummer 19, Oktober 1980, S. 4405–4421, PMID 6253917, PMC 324248 (freier Volltext).
  13. ↑ R. C. Wiegand, G. N. Godson, C. M. Radding: Specificity of the S1 nuclease from Aspergillus oryzae. In: The Journal of biological chemistry. Band 250, Nummer 22, November 1975, S. 8848–8855, PMID 171268.
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