Protospacer Adjacent Motif

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Protospacer adjacent Motif (PAM, ‚Vorabstandshalter-angrenzendes Motiv‘ bzw. Protospacer-Nachbarmotiv) ist in der Biochemie ein Sequenzmotiv von DNA, an das die Endonucleasen vom Typ Cas binden.[1]

Eigenschaften

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Das PAM besteht aus 2 bis 6 Nukleotiden. Das PAM ist die Bindungsstelle für Cas auf der zu schneidenden DNA. Cas9 kommt sowohl in der antiviralen Abwehr von Bakterien (CRISPR), als auch im Zuge der CRISPR/Cas-Methode zum Genome Editing vor. Ohne eine PAM hinter der zu schneidenden Sequenz erfolgt kein Schnitt der DNA.[2][3][4][5] In bakteriellen Genomen kommt das PAM nicht in Kombination mit Erkennungssequenzen vor, weshalb es in Bakterien zur Erkennung fremder DNA dient.[6] Die von Cas9 aus Streptococcus pyogenes gebundene Sequenz ist 5'-NGG-3', mit N als beliebige Nukleinbase gefolgt von zwei Guaninen.[7] Die Sequenz des PAM unterscheidet sich zwischen den Cas9-Varianten Streptococcus pyogenes und Neisseria meningitidis, Treponema denticola und Streptococcus thermophilus.[8] Daneben kann auch ein Schnitt vor der Sequenz 5'-NGA-3' mit A als Adenosin erfolgen.[9] Das PAM für Cas12b aus Alicyclobacillus acidoterrestris besitzt die Sequenz 5'-TTN-3'.[10]

Ansätze des Protein-Engineering zur Erweiterung der Substratspezifität von Cas9 durch Veränderung der PAM-Bindungsstelle wurden untersucht.[11] Das Cas9 von Francisella novicida wurde verändert, so dass die PAM 5'-YG-3' mit Y als ein beliebiges Pyrimidin erkannt wird und ein Schnitt erfolgt.[12][13] Das Cas12a (vormals Cpf1[14]) von Francisella novicida bindet die PAM 5'-TTTN-3' mit T als Thymidin[15] oder 5'-YTN-3'.[16] Cas13 Proteine, wie Cas13a von Leptotrichia shahii (vormals C2c2), binden und schneiden RNA anstatt DNA und binden zum Teil an eine Protospacer Flanking Site (PFS) anstatt an ein PAM. Diese PFS besteht bei Cas13a von Leptotrichia shahii zum Beispiel aus einem beliebigen Nukleotid außer Guanosin.[17][18] Es wurde jedoch gezeigt, dass Cas13 Proteine anderer Spezies keine PFS zur Bindung benötigen.[19][20]

Einzelnachweise

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  1. ↑ S. A. Shah, S. Erdmann, F. J. Mojica, R. A. Garrett: Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity. In: RNA biology. Band 10, Nummer 5, Mai 2013, S. 891–899, doi:10.4161/rna.23764, PMID 23403393, PMC 3737346 (freier Volltext).
  2. ↑ Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Almendros C: Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. In: Microbiology. 155. Jahrgang, Pt 3, 2009, S. 733–740, doi:10.1099/mic.0.023960-0, PMID 19246744 (sgmjournals.org).
  3. ↑ Shah SA, Erdmann S, Mojica FJ, Garrett RA: Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity. In: RNA Biology. 10. Jahrgang, Nr. 5, 2013, S. 891–899, doi:10.4161/rna.23764, PMID 23403393, PMC 3737346 (freier Volltext) – (englisch, landesbioscience.com (Memento des Originals vom 4. September 2014 im Internet Archive) [abgerufen am 23. Oktober 2017]).
  4. ↑ Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E: A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. In: Science. 337. Jahrgang, Nr. 6096, 2012, S. 816–821, doi:10.1126/science.1225829, PMID 22745249 (sciencemag.org).
  5. ↑ Sternberg SH, Redding S, Jinek M, Greene EC, Doudna JA: DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. In: Nature. 507. Jahrgang, Nr. 7490, 2014, S. 62–67, doi:10.1038/nature13011, PMID 24476820, PMC 4106473 (freier Volltext).
  6. ↑ Mali P, Esvelt KM, Church GM: Cas9 as a versatile tool for engineering biology. In: Nature Methods. 10. Jahrgang, Nr. 10, 2013, S. 957–963, doi:10.1038/nmeth.2649, PMID 24076990, PMC 4051438 (freier Volltext) – (nature.com).
  7. ↑ Anders C, Niewoehner O, Duerst A, Jinek M: Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. In: Nature. 513. Jahrgang, Nr. 7519, 2014, S. 569–573, doi:10.1038/nature13579, PMID 25079318, PMC 4176945 (freier Volltext).
  8. ↑ Esvelt KM, Mali P, Braff JL, Moosburner M, Yaung SJ, Church GM: Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. In: Nature Methods. 10. Jahrgang, Nr. 11, 2013, S. 1116–1123, doi:10.1038/nmeth.2681, PMID 24076762, PMC 3844869 (freier Volltext).
  9. ↑ Zhang Y, Ge X, Yang F, Zhang L, Zheng J, Tan X, Jin ZB, Qu J, Gu F: Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells. In: Scientific Reports. 4. Jahrgang, 2014, S. 5405, doi:10.1038/srep05405, PMID 24956376, PMC 4066725 (freier Volltext).
  10. ↑ UniProt cas12b - CRISPR-associated endonuclease Cas12b - Alicyclobacillus acidoterrestris (strain ATCC 49025 / DSM 3922 / CIP 106132 / NCIMB 13137 / GD3B) - cas12b gene. Abgerufen am 24. Januar 2019.
  11. ↑ Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, Topkar VV, Nguyen NT, Zheng Z, Gonzales AP, Li Z, Peterson RT, Yeh JR, Aryee MJ, Joung JK: Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. In: Nature. 523. Jahrgang, Nr. 7561, 2015, S. 481–485, doi:10.1038/nature14592, PMID 26098369, PMC 4540238 (freier Volltext).
  12. ↑ Nucleotide Codes, Amino Acid Codes, and Genetic Codes. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, 15. Juli 2014, abgerufen am 6. April 2016.
  13. ↑ Hirano H, Gootenberg JS, Horii T, Abudayyeh OO, Kimura M, Hsu PD, Nakane T, Ishitani R, Hatada I, Zhang F, Nishimasu H, Nureki O: Structure and Engineering of Francisella novicida Cas9. In: Cell. 164. Jahrgang, Nr. 5, 2016, S. 950–961, doi:10.1016/j.cell.2016.01.039, PMID 26875867, PMC 4899972 (freier Volltext).
  14. ↑ Kira S. Makarova, Yuri I. Wolf, Eugene V. Koonin: Evolutionary Classification of CRISPR‐Cas Systems. In: Crispr. 1. Auflage. Wiley, 2022, ISBN 978-1-68367-037-7, S. 13–38, doi:10.1002/9781683673798.ch2 (wiley.com [abgerufen am 25. August 2024]).
  15. ↑ Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, Zhang F: Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. In: Cell. 163. Jahrgang, Nr. 3, 2015, S. 759–771, doi:10.1016/j.cell.2015.09.038, PMID 26422227.
  16. ↑ Fonfara I, Richter H, Bratovič M, Le Rhun A, Charpentier E: The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. In: Nature. 532. Jahrgang, Nr. 7600, 2016, S. 517–521, doi:10.1038/nature17945, PMID 27096362.
  17. ↑ Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, Joung J, Slaymaker IM, Cox DB, Shmakov S, Makarova KS, Semenova E, Minakhin L, Severinov K, Regev A, Lander ES, Koonin EV, Zhang F: C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. In: Science. 2016, doi:10.1126/science.aaf5573, PMID 27256883.
  18. ↑ Kira S. Makarova, Feng Zhang, Eugene V. Koonin: SnapShot: Class 2 CRISPR-Cas Systems. In: Cell. Band 168, Nr. 1-2, Januar 2017, S. 328–328.e1, doi:10.1016/j.cell.2016.12.038 (elsevier.com [abgerufen am 17. Mai 2020]).
  19. ↑ Omar O. Abudayyeh, Jonathan S. Gootenberg, Patrick Essletzbichler, Shuo Han, Julia Joung: RNA targeting with CRISPR–Cas13. In: Nature. Band 550, Nr. 7675, Oktober 2017, ISSN 0028-0836, S. 280–284, doi:10.1038/nature24049, PMID 28976959, PMC 5706658 (freier Volltext) – (nature.com [abgerufen am 17. Mai 2020]).
  20. ↑ David B. T. Cox, Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh, Brian Franklin, Max J. Kellner: RNA editing with CRISPR-Cas13. In: Science. Band 358, Nr. 6366, 24. November 2017, ISSN 0036-8075, S. 1019–1027, doi:10.1126/science.aaq0180, PMID 29070703, PMC 5793859 (freier Volltext) – (sciencemag.org [abgerufen am 17. Mai 2020]).
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