CRISPR/Cas12b-Methode
Die CRISPR/Cas12b-Methode ist eine biochemische Methode um DNA zu schneiden. Sie ist eine Variante der CRISPR/Cas-Methode unter Verwendung der Endonuklease Cas12b.
Prinzip
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]Cas12b (alter Name C2c1, ein Cas des Typs V, Klasse II) bindet wie andere Cas-Proteine (Cas9, Cpf1) eine RNA mit einer crRNA repeat-Sequenz und einer crRNA spacer-Sequenz und schneidet in der unmittelbaren Umgebung doppelsträngige DNA unter Erzeugung eines sticky end-Doppelstrangbruchs. Weitere notwendige Faktoren sind das Vorhandensein einer tracrRNA und ein Protospacer Adjacent Motif (PAM) in der zu schneidenden Ziel-DNA. Die auf die von Cas12b gebundene crRNA repeat-Sequenz folgende crRNA spacer-Sequenz bindet an die Ziel-DNA.
Typen
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]Cas12b aus Alicyclobacillus acidoterrestris, abgekürzt AacCas12b, besteht aus 1129 Aminosäuren und bindet an eine PAM der Sequenz TTN in der Ziel-DNA.[1] Der Schnitt der Ziel-DNA erzeugt einen sticky end mit einem 5′-Überhang von 6–8 Nukleotiden 14–17 Nukleotide strangabwärts vom PAM auf dem non-target-Strang bzw. 23–24 Nukleotide strangabwärts vom PAM auf dem target-Strang.[1] Cas12b schneidet DNA bei einer Temperatur zwischen 37 und 60 °C,[1] das Temperatur-Optimum liegt bei 48 °C.[2] Bei 37 °C ist die Enzymaktivität vergleichsweise gering.[3] Im Vergleich zu Cas9 oder Cpf1 (synonym Cas12a) erzeugt Cas12b weniger unspezifische Schnitte.[4]
Cas12b aus Bacillus hisashii, abgekürzt BhCas12b, ist mit 1108 Aminosäuren kleiner als SpCas9 (1368 Aminosäuren) und hat daher auch ein kleineres Gen, was die Verwendung in viralen Vektoren (insbesondere AAV-Vektoren) erleichtert.[3] Eine Verkürzung einer sgRNA um fünf Nukleotide am 5′-Ende verdreißigfacht die Enzymaktivität.[3] Allerdings erzeugt der Wildtyp von BhCas12b bei 37 °C nur Einzelstrangbrüche.[3] Daher wurde eine Mutante von BhCas12b namens BhCas12b v4 entwickelt (K846R/S893R/E837G), die auch bei der Körpertemperatur von Säugetieren Doppelstrangbrüche und weniger unspezifische Schnitte erzeugt.[3]
Einzelnachweise
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]- ↑ a b c UniProt T0D7A2: cas12b - CRISPR-associated endonuclease Cas12b - Alicyclobacillus acidoterrestris (strain ATCC 49025 / DSM 3922 / CIP 106132 / NCIMB 13137 / GD3B) - cas12b gene (uniprot.org) (englisch) 16. Oktober 2013, 24. Januar 2019
- ↑ S. Shmakov, O. O. Abudayyeh, K. S. Makarova, Y. I. Wolf, J. S. Gootenberg, E. Semenova, L. Minakhin, J. Joung, S. Konermann, K. Severinov, F. Zhang, E. V. Koonin: Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. In: Molecular cell. Band 60, Nummer 3, November 2015, S. 385–397, doi:10.1016/j.molcel.2015.10.008, PMID 26593719, PMC 4660269 (freier Volltext).
- ↑ a b c d e Jonathan Strecker, Sara Jones, Balwina Koopal, Jonathan Schmid-Burgk, Bernd Zetsche, Linyi Gao, Kira S. Makarova, Eugene V. Koonin & Feng Zhang: Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing. In: Nature Communications. Band 10, Nummer 1, Januar 2019, S. 212, doi:10.1038/s41467-018-08224-4, PMID 30670702.
- ↑ L. Liu, P. Chen, M. Wang, X. Li, J. Wang, M. Yin, Y. Wang: C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism. In: Molecular cell. Band 65, Nummer 2, Januar 2017, S. 310–322, doi:10.1016/j.molcel.2016.11.040, PMID 27989439.