Die Tweede Divisie 1959/60 war die vierte Spielzeit der dritthöchsten niederländischen Fußballliga. An ihr nahmen insgesamt 25 Mannschaften teil, die in zwei Gruppen zu 12 und 13 Teams aufgeteilt wurden.
Die Vereine spielten aufgeteilt in einer Hin- und einer Rückrunde jeweils zwei Mal gegeneinander. Die beiden Gruppensieger stiegen direkt in die Eerste Divisie auf. Die beiden punktgleichen Gruppenzweiten und -dritten spielten in Play-offs weitere drei Aufsteiger aus. Die letzten drei Teams jeder Gruppe sowie die Vorletzten der vergangenen Saison spielten in einer Abstiegsrunde vier Absteiger aus. Die Abstiegsregelung war ein Versuch des KNVB, die Liga eingleisig zu gestalten.
Für die letztjährigen vier Aufsteiger kamen aus der Eerste Divisie die Absteiger HFC Haarlem und Roda Sport Kerkrade hinzu. FC Hilversum, Velox Utrecht, SV Zeist aus der Gruppe A, sowie NEC Nijmegen aus der Gruppe B wechselten in die jeweils andere Gruppe.
Zunächst spielten jeweils der punktgleiche Gruppendritte und -zweite in einem Match gegeneinander. Der Sieger stieg in die Eerste Divisie auf. Die beiden unterlegenen Mannschaften ermittelten dann in Hin- und Rückspiel den letzten Aufsteiger.
