Die Tweede Divisie 1964/65 war die neunte Spielzeit der dritthöchsten niederländischen Fußballliga. An ihr nahmen insgesamt 31 Mannschaften teil, die in zwei Gruppen zu 16 und 15 Teams aufgeteilt wurden.
Die Vereine spielten aufgeteilt in einer Hin- und einer Rückrunde jeweils zwei Mal gegeneinander. Die beiden Gruppensieger spielten den ersten Aufsteiger aus. Der zweite Aufsteiger wurde in einer Aufstiegsrunde zwischen dem verbliebenen Ersten, den beiden Tabellenzweiten, sowie den besten Dritten ermittelt. Das Entscheidungsspiel um den Absteiger zwischen den beiden Tabellenletzten wurde hinfällig, nachdem TSV LONGA freiwillig zu den Amateuren wechselte.
Für die beiden letztjährigen Aufsteiger kamen aus der Eerste Divisie die Absteiger Fortuna Vlaardingen und BVV Den Bosch. Be Quick 1887 und Kooger FC zogen sich letztes Jahr freiwillig in den Amateurbereich zurück. Dafür kam der FC Zaanstreek, der die Lizenz von Kooger erbte. VV Leeuwarden trat unter dem Namen SC Cambuur an. Insgesamt sechs Vereine hatten die Gruppe gewechselt.
TSV LONGA wechselte anschließend freiwillig zu den Amateuren. Daher gab es keine Rückspiel und kein Spiel gegen SV Zwolsche Boys, Letzter der Gruppe A.
