Die Tweede Divisie 1965/66 war die zehnte Spielzeit der dritthöchsten niederländischen Fußballliga. An ihr nahmen insgesamt 30 Mannschaften teil, die in zwei Gruppen zu je 15 Teams aufgeteilt wurden. Es war die letzte Saison mit zwei Gruppen. Ab der folgenden Saison spielten alle Vereine in der eingleisigen Liga. Daher stiegen in diesem Jahr insgesamt acht Teams in die Eerste Divisie auf. Keine Mannschaft musste in den Amateurfußball absteigen.
Die Vereine spielten an insgesamt 28 Spieltagen aufgeteilt in einer Hin- und einer Rückrunde jeweils zwei Mal gegeneinander. Aus beiden Gruppen stiegen die ersten vier Teams auf. Absteiger gab es nicht.
Für die beiden letztjährigen Aufsteiger kamen aus der Eerste Divisie die Absteiger SC Veendam und Excelsior Rotterdam. HVV 't Gooi trat unter dem Namen SC Gooiland an. Insgesamt fünf Vereine hatten die Gruppe gewechselt.
